Genotypisierung und Nukleinsäureanalytik an Saatgutpartien und Zuchtmaterial.

DNA-Extraktion

Isolation genomischer DNA aus Saatgut und Blattmaterial über silica-beschichtete Magnetbeads mit einem von HelixSeed entwickelten Kit, im Hochdurchsatz.

Hintergrund: Saatgut enthält Stoffe, die die PCR hemmen können (Polysaccharide, Polyphenole, Speicherlipide). Eine standardisierte Extraktion stellt sicher, dass Unterschiede im Ergebnis aus der Genetik kommen – nicht aus der Probenaufbereitung. Ablauf Schritt für Schritt →

Spektrophotometrische Reinheit

Spektralphotometrische Bestimmung von Nukleinsäurekonzentration und Reinheitsverhältnissen (A260/280, A260/230) als Mikrovolumen-Messung vor Genotypisierung und Sequenzierung, ergänzt durch Agarose-Gelelektrophorese zur Prüfung der DNA-Integrität.

Hintergrund: Zu wenig DNA führt zu Ausfällen. Ungenügende Reinheit – Proteine, Phenole, Polysaccharide oder Salzreste – hemmt die Polymerase: schwache oder fehlende Amplifikation, verschmierte KASP-Cluster, verschobene HRM-Kurven und bei Nanopore geringere Ausbeute, weil Verunreinigungen Poren blockieren können. Die Messung ist deshalb ein Qualitätstor zwischen Extraktion und Assay. Messprinzip →

Sortenreinheit

Kernfrage ist: Wie viel Prozent der Partie sind Fremdtypen (Off-Types)? Wir bestimmen das semiquantitativ an einer repräsentativen Stichprobe von 400 Körnern, über PCR und HRM-Schmelzkurvenanalyse.

Bei Selbstbefruchtern wie Weizen, Gerste oder Soja sind Sorten weitgehend homozygot und einheitlich – jede Abweichung vom Sortenprofil ist ein klares Signal. Bei Fremdbefruchtern wie Roggen oder Mais ist eine gewisse Variation sortentypisch; hier wird gegen Allelfrequenzen bzw. bei Hybriden gegen das erwartete Elternprofil bewertet. Bei polyploidem Weizen werden subgenomspezifische Marker benötigt (siehe Allel).

Prinzip

1. Referenz: Für die deklarierte Sorte wird an einem definierten Genomabschnitt, an dem sie sich von Fremdtypen unterscheidet, die Referenzschmelzkurve festgelegt (Ideallinie).
2. Stichprobe: Aus der Charge wird eine repräsentative Stichprobe von 400 Körnern entnommen.
3. PCR und HRM: Der Genomabschnitt wird per PCR vervielfältigt und per HRM geschmolzen.
4. Auswertung: Aus der Abweichung der Schmelzkurve von der Ideallinie wird auf den prozentualen Anteil an Fremdtypen in der Charge geschlossen.

Internationale Grundsätze zur Auswahl molekularer Marker für die Sortenidentifizierung beschreibt die UPOV in ihren „BMT Guidelines“ (UPOV/INF/17). Ablauf im Detail →

Züchtungsprojekte

Genotypisierung von Zuchtlinien und Segregationspopulationen zur Identitäts- und Linienkontrolle, mit Dokumentation zwischen Zuchtgarten und Labor.

Hintergrund: In Zuchtprogrammen werden Linien über viele Generationen gekreuzt, vermehrt und ausgewählt. Verwechslungen oder ungewollte Einkreuzungen fallen im Feld oft erst spät auf. Ein molekulares Profil je Linie macht ihre Identität überprüfbar und nachvollziehbar dokumentiert.

Merkmalsgenotypisierung mit KASP

Linien und Nachkommen werden mit KASP-Markern genotypisiert, die eng mit einem Merkmal gekoppelt sind, etwa Krankheitsresistenz oder Trocken- und Hitzetoleranz. So lässt sich schon am Keimling feststellen, ob eine Pflanze die gewünschte Genvariante trägt, bevor sich das Merkmal im Feld zeigt. Ein Marker ist dabei nur so aussagekräftig wie seine belegte Kopplung zum Merkmal.

Hintergrund: Bei der markergestützten Selektion werden Nachkommen schon im Keimlingsstadium auf das gewünschte Allel geprüft. Pflanzen ohne Zielallel müssen nicht bis zur Reife angebaut werden; das spart Fläche und Zeit. Bei Rückkreuzungsprogrammen helfen Marker außerdem, den Anteil des Elterngenoms gezielt zu steuern (Collard & Mackill 2008). Wie KASP funktioniert →

Markeridentifizierung

Identifikation diagnostischer Polymorphismen (SNP und indel) zwischen Linien bzw. zwischen toleranten und anfälligen Genotypen, einschließlich Trocken- und Hitzemarkern.

Vom Sequenzunterschied zum Routinemarker

1. Kandidaten finden: Vergleich von Sequenzen der zu unterscheidenden Linien; gesucht sind Polymorphismen, die in der relevanten Population tatsächlich variieren.
2. Assay entwerfen: Primer für KASP oder HRM um den Polymorphismus.
3. Validieren: Prüfung an Material mit bekanntem Genotyp bzw. Phänotyp; nur Marker mit eindeutiger Trennung und – für Merkmale – nachgewiesener Kopplung (QTL) sind diagnostisch brauchbar.
4. Routine: Einsatz im Hochdurchsatz.

Methylierungsanalyse Coming soon

Nachweis von 5-Methylcytosin in pflanzlicher gDNA in den Sequenzkontexten CG, CHG und CHH. Ergänzung zur Nukleotidsequenz, soweit Methylierung für Saatgutphysiologie oder abiotische Toleranz relevant ist.

Hintergrund: DNA-Methylierung ist eine chemische Markierung, die die Basenfolge nicht verändert, aber die Aktivität von Genen und transponierbaren Elementen beeinflussen kann. In Pflanzen wird sie in allen drei Kontexten gesetzt – durch teils verschiedene Enzymsysteme (Law & Jacobsen 2010). Klassisch wird Methylierung über Bisulfit-Konversion und Sequenzierung bestimmt; die Nanopore-Sequenzierung erkennt 5mC direkt im nativen Strang.

Sequenzierung Coming soon

Nukleotidbestimmung über definierte Loci bzw. längere Fragmente. Einsatz, wenn Einzelmarker-Assays (HRM, KASP) für Identität oder Markerentwicklung nicht ausreichen.

Wie Nanopore-Sequenzierung funktioniert →

Literatur & weiterführende Quellen

1. Collard B. C. Y., Mackill D. J. (2008): Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Phil. Trans. R. Soc. B 363, 557–572.
2. Semagn K. et al. (2014): Single nucleotide polymorphism genotyping using KASP. Molecular Breeding 33, 1–14.
3. Law J. A., Jacobsen S. E. (2010): Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Nature Reviews Genetics 11, 204–220.
4. UPOV: Guidelines for DNA-Profiling: Molecular Marker Selection and Database Construction („BMT Guidelines“), Dokument UPOV/INF/17. upov.int
5. ISTA: International Rules for Seed Testing. seedtest.org