Wie aus einer Ernte Gewissheit wird.

Semiquantitative Saatgutreinheit

Die Kernfrage lautet: Wie hoch ist der Anteil an Fremdtypen (Off-Types) in einer Saatgutcharge? Wir beantworten sie mit einer Kombination aus repräsentativer Stichprobe, PCR und HRM-Schmelzkurvenanalyse.

1. Probenahme: Aus der gewünschten Saatgutcharge wird eine repräsentative Stichprobe von 400 Körnern entnommen.
2. DNA-Gewinnung: Aus der Stichprobe wird genomische DNA extrahiert und auf ihre Reinheit geprüft (siehe unten).
3. PCR: Ein definierter Genomabschnitt, an dem sich die Sorte von Fremdtypen unterscheidet, wird per PCR vervielfältigt.
4. HRM: Das PCR-Produkt wird schrittweise erhitzt und geschmolzen; dabei wird die Schmelzkurve aufgezeichnet.
5. Auswertung: Die Kurve wird mit der Ideallinie verglichen, der Referenzschmelzkurve der reinen Sorte. Aus der Abweichung von dieser Ideallinie wird auf den prozentualen Anteil an Off-Types bzw. Fremdtypen in der Charge geschlossen.

Semiquantitativ heißt: Das Ergebnis ist eine Abschätzung des Fremdanteils in der Charge, keine Auszählung einzelner Körner. Wie fein sich Anteile unterscheiden lassen, hängt vom gewählten Genomabschnitt, von der Sorte und von der Stichprobe ab.

Auch unsere anderen Analysen folgen dieser Kette aus Probe, Extraktion, Reinheitsprüfung und PCR-basiertem Auslesen, sei es über Fluoreszenzcluster (KASP), Schmelzkurven (HRM) oder die Basenfolge (Sequenzierung). Ein Ergebnis ist immer nur so gut wie das schwächste Glied dieser Kette.

DNA-Extraktion mit silica-beschichteten Magnetbeads

Saatgut ist ein anspruchsvolles Ausgangsmaterial: Stärke, Speicherproteine, Polysaccharide, Öle und Polyphenole können nachfolgende Enzymreaktionen hemmen. Ziel der Extraktion ist daher nicht nur „viel“ DNA, sondern DNA, die frei von solchen Inhibitoren ist.

Wir extrahieren mit einem von HelixSeed entwickelten Kit auf Basis silica-beschichteter Magnetbeads. In Gegenwart chaotroper Salze bindet die DNA an die Silica-Oberfläche der Partikel. Ein Magnet hält die Partikel fest, während Verunreinigungen abgewaschen werden.

Ablauf Schritt für Schritt

1. Homogenisieren: Körner oder Blattstücke werden in einer Schwingmühle mechanisch zerkleinert, damit Zellwände aufgeschlossen werden.
2. Lyse: Ein Puffer mit Detergens löst Membranen, Proteinase baut Proteine ab; DNA geht in Lösung.
3. Klären: Zentrifugation trennt unlösliche Reste ab.
4. Binden: Magnetbeads und ein Bindepuffer mit chaotropen Salzen werden zugegeben; die DNA bindet an die Partikel.
5. Waschen: Ethanolwäsche.
6. Eluieren: In salzarmem Puffer oder Wasser löst sich die DNA wieder von den Beads und wird abgenommen.

Der Vorteil gegenüber Säulen- oder Phenol-Chloroform-Verfahren liegt in der guten Automatisierbarkeit im 96-Well-Format: Alle Proben einer Charge durchlaufen exakt dieselbe Chemie.

Spektrophotometrische Reinheit (UV-Vis)

Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht mit einem Maximum bei 260 nm, verursacht durch die aromatischen Ringe der Basen. Wir messen als Mikrovolumen-Messung (NanoDrop): 1–2 µl Probe werden direkt zwischen zwei Messflächen vermessen, ohne Küvette. Neben der Konzentration liefern zwei Quotienten Hinweise auf die Reinheit:

• A260/280 – um 1,8 für reine DNA; niedriger bei Protein- oder Phenolresten.
• A260/230 – typisch etwa 2,0–2,2; niedriger bei Salzen, Kohlenhydraten oder Phenolen.

Integrität: Agarose-Gelelektrophorese

Zusätzlich prüfen wir die DNA per Agarose-Gelelektrophorese. Im elektrischen Feld wandern DNA-Fragmente je nach Größe unterschiedlich weit durch das Gel. Intakte genomische DNA zeigt sich als scharfe, hochmolekulare Bande, abgebaute DNA als „Schmier“ hin zu kleineren Fragmenten. Die Photometrie beantwortet also die Frage nach Menge und Reinheit, das Gel die Frage, ob die DNA intakt ist.

Was passiert bei ungenügender Reinheit?

Rückstände aus Saatgut und Extraktion – Proteine, Phenole, Polysaccharide, chaotrope Salze, Ethanol – können die Polymerase hemmen. Typische Folgen: schwache oder ausbleibende Amplifikation, verschmierte KASP-Cluster und vermehrt nicht auswertbare Proben, verschobene oder verrauschte HRM-Kurven sowie bei der Nanopore-Sequenzierung geringere Ausbeute, weil Verunreinigungen Poren blockieren und Motorproteine stören können.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR vervielfältigt einen genau definierten DNA-Abschnitt. Zwei Primer flankieren den Zielbereich; eine hitzestabile DNA-Polymerase verlängert sie. Jeder Zyklus verdoppelt im Idealfall die Zahl der Kopien – nach 30 Zyklen sind aus einer Vorlage theoretisch rund eine Milliarde (2³⁰) Kopien geworden.

Ein Zyklus in drei Schritten

1. Denaturierung (~95 °C): Der Doppelstrang trennt sich in Einzelstränge.
2. Anlagerung / Annealing (~55–65 °C): Die Primer binden an ihre komplementären Stellen.
3. Verlängerung / Elongation (~72 °C): Die Polymerase synthetisiert den neuen Strang.

Bei der Echtzeit-PCR (qPCR) wird die Fluoreszenz während oder nach den Zyklen gemessen. KASP und HRM sind spezielle Auslese-Formate auf dieser Grundlage.

PCR und Sequenzierung

Auch viele Sequenzierverfahren bauen auf PCR auf: Bei Illumina werden Bibliotheken meist per PCR angereichert und auf der Flowcell durch Brückenamplifikation zu Clustern vervielfältigt (es gibt auch PCR-freie Bibliotheksprotokolle). Die Sanger-Sequenzierung nutzt Cycle Sequencing, eine PCR-verwandte Reaktion mit kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden. Die Nanopore-Sequenzierung kann dagegen native, nicht amplifizierte DNA lesen – PCR-frei, wodurch auch Basenmodifikationen wie Methylierung erhalten bleiben.

KASP – kompetitive allelspezifische PCR

KASP dient dazu, an einem bekannten SNP zu bestimmen, welche Allele eine Probe trägt. Zwei vorwärts gerichtete Primer konkurrieren um dieselbe Stelle; sie unterscheiden sich nur in der letzten Base am 3′-Ende, die genau auf dem SNP liegt. Ein gemeinsamer Rückwärtsprimer schließt das Amplicon ab.

Wie das Signal entsteht: die FRET-Kassette

Das Besondere an KASP: Die Fluoreszenz stammt nicht von einer markerspezifischen Sonde, sondern von einer universellen FRET-Kassette, die für jeden Marker gleich ist und keine Sequenz des Zielgenoms erkennt. Das Prinzip ist verwandt mit der Amplifluor-Technik, bei der ebenfalls universelle, fluoreszenzmarkierte Reporterprimer über angehängte Schwanzsequenzen an das PCR-Produkt gekoppelt werden.

1. Primer mit Schwanz: Jeder der beiden allelspezifischen Primer trägt am 5′-Ende eine eigene, kurze Schwanzsequenz („Tail“), die nicht im Zielgenom vorkommt. Ein Tail steht für Allel X, der andere für Allel Y.
2. Allelspezifische Verlängerung: Passt die 3′-Base zur Vorlage, verlängert die Polymerase effizient; bei Fehlpaarung kaum.
3. Das Tail-Komplement entsteht: In den ersten Zyklen wird der Tail ins Produkt eingebaut. Wird anschließend vom gemeinsamen Rückwärtsprimer aus der Gegenstrang synthetisiert, enthält dieser die zum Tail komplementäre Sequenz.
4. Kassette im Ruhezustand: Im Reaktionsmix liegt je Allel ein fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid (FAM bzw. HEX), dessen Sequenz dem jeweiligen Tail entspricht. Es ist an ein komplementäres Oligonukleotid mit einem Quencher hybridisiert. Farbstoff und Quencher liegen so dicht beieinander, dass die Anregungsenergie per FRET auf den Quencher übergeht: Die Fluoreszenz ist gelöscht.
5. Signal: Sobald das Tail-Komplement im Produkt vorliegt, bindet das markierte Oligonukleotid dort als Primer und wird in neue Stränge eingebaut. Damit ist es dauerhaft vom Quencher-Oligonukleotid getrennt, und der Farbstoff fluoresziert. Mit jedem Zyklus wächst das Signal der zum Allel passenden Farbe.
6. Endpunktmessung: Nach der PCR wird für jede Probe die FAM- und die HEX-Fluoreszenz gemessen und in ein Clusterdiagramm übertragen.

Stärken: hoher Probendurchsatz, geringe Kosten je Datenpunkt, eindeutige Auswertung. Voraussetzung: Der SNP und seine flankierende Sequenz müssen bekannt sein, und der Marker muss für die Fragestellung validiert sein.

Jede Einzelprobe landet in genau einem Cluster: homozygot X, homozygot Y oder heterozygot. Typische Einsatzgebiete sind daher validierte Merkmalsmarker in der Züchtung (siehe Merkmalsgenotypisierung) sowie Identitäts- und Linienkontrolle. Die semiquantitative Bestimmung der Sortenreinheit einer Charge führen wir dagegen mit PCR und HRM durch (siehe Saatgutreinheit).

HRM – hochauflösende Schmelzkurvenanalyse

Nach der PCR liegt das Amplicon als doppelsträngige DNA vor. Ein sättigender, interkalierender Fluoreszenzfarbstoff (z. B. LCGreen, EvaGreen) fluoresziert stark, solange er im Doppelstrang gebunden ist. Wird die Probe in kleinen Schritten (z. B. 0,1 °C) erhitzt, trennen sich die Stränge und die Fluoreszenz fällt ab.

Die Schmelztemperatur und die Form der Kurve hängen von Sequenz, Länge und GC-Gehalt ab. Schon ein einzelner Basenaustausch kann die Kurve verschieben. Besonders charakteristisch sind heterozygote Proben: Beim Abkühlen bilden sich auch fehlgepaarte „Heteroduplexe“, die früher schmelzen und die Kurvenform deutlich verändern.

HRM ist eine elegante Lösung: Die Analyse läuft im geschlossenen Röhrchen direkt im Anschluss an die PCR, ohne Sonden und ohne Öffnen der Reaktion (geringes Kontaminationsrisiko) – schnell und kostengünstig.

HRM benötigt keine allelspezifischen Sonden und eignet sich daher gut zum Screenen und zum Sichtbarmachen von Uneinheitlichkeit. Wo die Variante noch nicht genau bekannt ist, kann HRM zeigen, dass sich Proben unterscheiden; worin, klärt bei Bedarf die Sequenzierung.

Sequenzierung mittels Nanopore Coming soon

Die Nanopore-Sequenzierung bauen wir bei HelixSeed derzeit auf. Hier erklären wir vorab, wie das Verfahren funktioniert.

Bei der Nanopore-Sequenzierung (Oxford Nanopore Technologies) sitzen Proteinporen in einer elektrisch isolierenden Membran. Eine angelegte Spannung treibt einen Ionenstrom durch jede Pore. Ein Motorprotein führt einen DNA-Einzelstrang kontrolliert hindurch; die jeweils in der Pore befindlichen Basen verändern den Strom charakteristisch. Ein Rechenmodell („Basecalling“) übersetzt das Stromsignal in die Basenfolge.

Weil einzelne Moleküle über viele Kilobasen gelesen werden (Long-Read), lassen sich auch repetitive Regionen und Strukturvarianten erfassen. Zudem verändern modifizierte Basen wie 5-Methylcytosin das Stromsignal, sodass Methylierung ohne Bisulfit-Behandlung direkt aus derselben Messung abgeleitet werden kann.

Vor- und Nachteile gegenüber Illumina

Wie sich die Genauigkeit verbessert: R10-Poren besitzen zwei Lesestellen („dual reader head“), sodass jede Base an mehr Messpunkten in der Pore erfasst wird – das verbessert insbesondere Homopolymere. Bei Duplex-Reads werden beide Stränge desselben Moleküls gelesen und abgeglichen. Dazu kommen fortlaufend genauere, KI-basierte Basecaller sowie Mehrfachabdeckung.

Entscheidend: die DNA-Qualität

Für Long-Reads ist die Aufreinigung der wichtigste Faktor. Nur reine, möglichst unfragmentierte hochmolekulare DNA (HMW-DNA) ergibt lange Reads; scherende Pipettierschritte, Nukleasen oder Rückstände (siehe Reinheit) begrenzen Leselänge und Ausbeute.

Welche Methode für welche Frage?

Literatur & weiterführende Quellen

1. Mullis K. B., Faloona F. A. (1987): Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155, 335–350.
2. Saiki R. K. et al. (1988): Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487–491.
3. Semagn K., Babu R., Hearne S., Olsen M. (2014): Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding 33, 1–14.
4. Myakishev M. V., Khripin Y., Hu S., Hamer D. H. (2001): High-throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with universal energy-transfer-labeled primers. Genome Research 11, 163–169.
5. Wittwer C. T., Reed G. H., Gundry C. N., Vandersteen J. G., Pryor R. J. (2003): High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical Chemistry 49, 853–860.
6. Reed G. H., Kent J. O., Wittwer C. T. (2007): High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics 8, 597–608.
7. Boom R., Sol C. J., Salimans M. M., Jansen C. L., Wertheim-van Dillen P. M., van der Noordaa J. (1990): Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology 28, 495–503.
8. Desjardins P., Conklin D. (2010): NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments 45, e2565.
9. Deamer D., Akeson M., Branton D. (2016): Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology 34, 518–524.
10. Simpson J. T. et al. (2017): Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing. Nature Methods 14, 407–410.
11. Lehrbuch zur Vertiefung: Alberts B. et al.: Molecular Biology of the Cell (aktuelle Auflage), Kapitel zu DNA-Replikation und Methoden der Molekularbiologie.